Isi
- Electrophorresis Memiliki Analisis Sampel Terbatas
- Pengukuran Elektroforesis Tidak Tepat
- Diperlukan Sampel Mulai yang Substansial
- Hanya Molekul Tertentu yang Dapat Divisualisasikan
- Elektroforesis adalah Throughput Rendah
Gel elektroforesis adalah teknik di mana molekul biologis dipisahkan satu sama lain dan diidentifikasi dalam penelitian biologi atau diagnostik medis. Sejak perkembangannya pada tahun 1970-an, teknik-teknik ini sangat berharga dalam mengidentifikasi gen (DNA) dan produk gen (RNA dan protein) yang menjadi perhatian penelitian. Dalam beberapa tahun terakhir, teknik baru telah muncul yang memberikan kekhususan dan detail yang lebih besar tentang apa yang terjadi dalam sistem kehidupan. Sementara ini belum menggantikan teknik elektroforesis, dan manipulasi lanjutan dapat memperluas kelayakan teknik, penting untuk menyadari apa yang dapat dan tidak bisa dilakukan elektroforesis gel.
Electrophorresis Memiliki Analisis Sampel Terbatas
Elektroforesis khusus untuk jaringan apa pun yang Anda sampel. Misalnya, jika Anda menjalankan Southern blot (sejenis elektroforesis) pada usap pipi, Anda melihat gen dari sel epitel pipi Anda dan tidak ada tempat lain di tubuh Anda. Kadang-kadang, ini bisa bermanfaat, tetapi peneliti sering tertarik pada efek yang lebih luas.
Teknik seperti hibridisasi in situ (ISH) dapat mengambil bagian jaringan dan menganalisis ekspresi gen di setiap area kecil sampel itu.Dengan demikian, para peneliti dapat melihat setiap area otak dalam sampel dengan ISH, sedangkan teknik elektroforesis hanya dapat melihat beberapa area pada suatu waktu.
Pengukuran Elektroforesis Tidak Tepat
Elektroforesis gel dapat secara efektif memisahkan protein serupa dengan bobot yang berbeda (ini adalah teknik yang disebut Western blotting). Ini dapat memisahkan mereka lebih tepat melalui teknik yang dikenal sebagai elektroforesis 2d; ini umum terjadi pada proteomik.
Sayangnya, semua pengukuran yang dilakukan dari teknik ini semi-kuantitatif yang terbaik. Untuk mendapatkan massa (berat) protein yang tepat, spektroskopi massa harus digunakan setelah protein dimurnikan dengan elektroforesis. Selanjutnya, membandingkan jumlah relatif dari molekul yang berbeda bergantung pada kerapatan pita (kegelapan) dari bintik-bintik yang berbeda pada gel. Metode ini memiliki beberapa tingkat kesalahan, dan sampel biasanya dijalankan beberapa kali untuk mendapatkan hasil yang bersih.
Diperlukan Sampel Mulai yang Substansial
Elektroforesis adalah teknik mengisolasi dan mengidentifikasi secara visual berbagai biomolekul. Ini dilakukan dengan melewatkan arus listrik melalui gel untuk memisahkan molekul bermuatan dengan bobot berbeda. Jika molekul yang Anda minati tidak cukup umum, band-nya akan hampir tidak terlihat dan sulit untuk diukur.
DNA dan RNA dapat diperkuat sedikit sebelum menjalankan elektroforesis, tetapi tidak praktis untuk melakukan ini dengan protein. Oleh karena itu, sampel jaringan besar diperlukan untuk menjalankan tes ini. Ini dapat membatasi kegunaan teknik, terutama dalam analisis medis. Hampir tidak mungkin menjalankan elektroforesis pada sampel dari sel tunggal; flow cytometry dan imunohistokimia lebih umum digunakan untuk menilai ekspresi protein sel-sel. Teknik yang disebut PCR sangat bagus untuk mengukur jumlah RNA yang sangat kecil.
Hanya Molekul Tertentu yang Dapat Divisualisasikan
Elektroforesis sangat baik untuk memisahkan dan mengidentifikasi biomolekul berukuran sedang hingga besar. Namun, banyak molekul yang peneliti ingin lihat lebih kecil; hormon kecil, neurotransmiter, dan ion tidak dapat diukur dengan elektroforesis. Ini karena dua alasan: mereka tidak bereaksi dengan benar dengan persiapan elektroforesis (biasanya teknik yang disebut SDS PAGE) dan, bahkan jika mereka melakukannya, mereka terlalu kecil untuk dipisahkan dengan benar dan akan keluar dari dasar gel dengan cepat. Molekul-molekul ini sebaliknya diukur dengan teknik seperti RIAA (immunoassay radio) dan ELISA (uji imunosorbant terkait-enzim).
Elektroforesis adalah Throughput Rendah
Elektroforesis gel umumnya throughput rendah, artinya tidak menghasilkan data dengan cepat. Elektroforesis kontras, di mana Anda dapat melihat sejumlah kecil molekul RNA pada suatu waktu, dengan PCR (reaksi berantai polimerase), yang secara bersamaan dapat menilai ribuan sampel. Demikian pula, flow cytometry dapat melakukan pengukuran dari ribuan sel individu dan membuat korelasi yang kompleks, sementara elektroforesis melihat sel-sel secara massal dan tidak dapat membuat pembedaan yang begitu halus. PCR dan flow cytometry masing-masing mewakili proses paralel dan serial secara masif, dan keduanya jauh melampaui kemampuan elektroforesis untuk menghasilkan data penelitian.