Isi
- Enzim Pembatasan dan Situs Pembatasan
- Orientasi yang Tepat
- Mengikat Ujung Lengket Membutuhkan Lebih Sedikit DNA
- Berbagai Enzim Dapat Memberikan Ujung Lengket yang Sama
Kloning molekuler adalah metode bioteknologi umum yang harus dipahami oleh setiap siswa dan peneliti. Kloning molekuler menggunakan jenis enzim yang disebut enzim restriksi untuk memotong DNA manusia menjadi fragmen yang kemudian dapat dimasukkan ke dalam DNA plasmid dari sel bakteri. Enzim restriksi memotong DNA untai ganda menjadi dua. Bergantung pada enzim restriksi, potongan dapat menghasilkan ujung lengket atau tumpul. Ujung lengket lebih berguna dalam kloning molekuler karena mereka memastikan bahwa fragmen DNA manusia dimasukkan ke dalam plasmid ke arah yang benar. Proses ligasi, atau penggabungan fragmen DNA, membutuhkan lebih sedikit DNA ketika DNA memiliki ujung yang lengket. Terakhir, beberapa enzim restriksi ujung lengket dapat menghasilkan ujung lengket yang sama, meskipun masing-masing enzim mengenali urutan restriksi yang berbeda. Ini meningkatkan kemungkinan bahwa wilayah DNA Anda yang menarik dapat dihilangkan dengan enzim ujung lengket.
Enzim Pembatasan dan Situs Pembatasan
Enzim restriksi adalah enzim yang memotong mengenali urutan spesifik pada DNA beruntai ganda dan memotong DNA menjadi setengah pada urutan itu. Urutan yang dikenal disebut situs pembatasan. Enzim restriksi disebut endonuklease karena mereka memotong DNA beruntai ganda, yaitu bagaimana DNA biasanya ada, di lokasi yang berada di antara ujung-ujung DNA. Ada lebih dari 90 enzim restriksi berbeda. Masing-masing mengakui situs pembatasan yang berbeda. Enzim restriksi memotong situs restriksi masing-masing 5.000 kali lebih efisien daripada situs lain yang tidak mereka kenal.
Orientasi yang Tepat
Enzim restriksi datang dalam dua kelas umum. Mereka memotong DNA menjadi ujung lengket atau ujung tumpul. Ujung yang lengket memiliki daerah pendek nukleotida, blok pembangun DNA, yang tidak berpasangan. Wilayah tidak berpasangan ini disebut overhang. Overhang dikatakan lengket karena ingin dan akan berpasangan dengan ujung lengket lain yang memiliki urutan overhang yang saling melengkapi. Ujung yang lengket seperti kembar yang sudah lama hilang, berusaha saling berpelukan erat setelah mereka bertemu. Di sisi lain, ujung tumpul tidak lengket karena semua nukleotida sudah berpasangan di antara dua untai DNA. Keuntungan dari ujung lengket adalah bahwa fragmen DNA manusia hanya dapat masuk ke dalam bakteri plasmid dalam satu arah. Sebaliknya, jika DNA manusia dan plasmid bakteri memiliki ujung yang tumpul, DNA manusia dapat dimasukkan head-to-tail atau tail-to-head ke dalam plasmid.
Mengikat Ujung Lengket Membutuhkan Lebih Sedikit DNA
Meskipun DNA dengan ujung tongkat memiliki waktu yang lebih mudah untuk menemukan satu sama lain karena "lengket," ujung lengket atau ujung tumpulnya tidak dapat bergabung bersama menjadi bagian DNA yang berkelanjutan. Pembentukan sepotong DNA terus menerus yang benar-benar terkait membutuhkan enzim yang disebut ligase. Ligase menghubungkan tulang punggung nukleotida pada ujung lengket atau tumpul, menghasilkan rantai nukleotida yang terus menerus. Karena ujung yang lengket menemukan satu sama lain lebih cepat karena ketertarikan mereka satu sama lain, proses ligasi membutuhkan lebih sedikit DNA manusia dan lebih sedikit DNA plasmid. Ujung tumpul dari DNA dan plasmid lebih kecil kemungkinannya untuk saling menemukan, dan dengan demikian ikatan ujung tumpul mensyaratkan lebih banyak DNA dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
Berbagai Enzim Dapat Memberikan Ujung Lengket yang Sama
Situs restriksi terletak di seluruh genom organisme, tetapi tidak ditempatkan secara merata. Pada plasmid, mereka dapat direkayasa untuk ditempatkan tepat di sebelah satu sama lain. Para ilmuwan yang ingin memotong sebuah fragmen DNA manusia dari genom manusia harus menemukan situs restriksi yang ada di depan dan di belakang wilayah fragmen tersebut. Selain memastikan bahwa suatu fragmen DNA dimasukkan ke arah yang benar, enzim ujung lengket yang berbeda dapat menciptakan ujung lengket yang sama meskipun mereka mengenali urutan pembatasan yang berbeda. Sebagai contoh, BamHI, BglII, dan Sau3A memiliki urutan pengenalan yang berbeda tetapi menghasilkan ujung lengket GATC yang sama. Hal ini meningkatkan kemungkinan bahwa akan ada situs restriktif lengket yang mengapit gen manusia yang Anda minati.