Isi
Ketika bekerja dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), kalibrasi yang baik sangat penting untuk memastikan hasil yang andal dan berkualitas. Kalibrasi instrumen HPLC yang benar dimulai dengan pembuatan standar kalibrasi yang sesuai. Dalam kebanyakan kasus, kalibrasi sebenarnya memerlukan serangkaian standar peningkatan konsentrasi untuk menghasilkan apa yang dikenal sebagai kurva kalibrasi. Ini adalah garis diplot dan persamaan terkait yang menggambarkan hubungan antara konsentrasi bahan kimia yang diuji dan respons detektor HPLC.
Tentukan bahan kimia yang ingin Anda uji untuk menggunakan HPLC ("analit"). Misalnya, Anda mungkin ingin menguji serangkaian minuman ringan untuk konten fruktosa, dalam hal ini fruktosa akan menjadi analit.
Dapatkan sejumlah bahan kimia analit dengan kemurnian yang sesuai. Biasanya kemurnian harus di atas 99% dan analit harus dibeli dari perusahaan pemasok bahan kimia terkemuka. Dalam kasus fruktosa, misalnya, Anda akan membeli fruktosa murni dari penjual bahan kimia dan bukan dari toko bahan makanan.
Tentukan konsentrasi analit maksimum dan minimum yang diantisipasi dalam sampel yang ingin Anda uji pada HPLC. Dalam hal minuman ringan, Anda akan memeriksa label minuman dan menentukan kandungan fruktosa terendah dan tertinggi di antara minuman yang akan Anda uji. Perlu diingat bahwa sampel awal (minuman ringan) dapat diencerkan atau dimanipulasi selama persiapan untuk analisis (tergantung pada metode HPLC yang digunakan) dan konsentrasi analit dalam sampel yang benar-benar disuntikkan ke HPLC dapat dimodifikasi. Ini adalah konsentrasi analit dalam sampel yang dijalankan pada HPLC yang harus dipertimbangkan.
Tentukan pelarut di mana Anda akan melarutkan analit Anda untuk membuat standar kalibrasi. Pelarut ini harus dapat melarutkan analit dengan baik pada rentang konsentrasi yang relatif luas (setidaknya setinggi dalam sampel yang ingin Anda uji). Selain itu, pelarut ini idealnya sangat mirip dengan "fase gerak:" pelarut yang digunakan untuk membawa sampel melalui instrumen HPLC.
Hitung jumlah analit yang diperlukan untuk membuat solusi "standar stok" dari analit. Ini ditemukan dengan mengalikan konsentrasi yang diperlukan dari standar stok dengan volume yang diinginkan. Konsentrasi analit dalam larutan ini harus setidaknya 10% lebih tinggi dari konsentrasi sampel yang diantisipasi tertinggi. Jika konsentrasi fruktosa tertinggi yang diantisipasi dalam sampel minuman ringan adalah 8 gram / 100 mililiter, maka standar stok dapat dibuat dengan konsentrasi 10 gram fruktosa / 100 mililiter. Volume yang masuk akal adalah 500 mililiter, oleh karena itu diperlukan 8/100 mL x 500 mL = 40 gram fruktosa.
Timbang jumlah analit yang diperlukan hingga tingkat presisi yang sesuai. Seringkali nilai berat dalam gram yang tepat untuk satu atau dua tempat desimal cocok, tetapi lebih presisi mungkin diperlukan untuk beberapa metode.
Pindahkan analit yang ditimbang ke labu volumetrik dari volume yang diperlukan dan tambahkan pelarut yang diinginkan ke tanda isian pada labu. Penggunaan labu volumetrik (bukan gelas kimia bertingkat, misalnya) meningkatkan ketepatan nilai konsentrasi standar stok. Pastikan bahwa semua analit ditransfer ke labu; gunakan beberapa pelarut untuk mencucinya, jika perlu.
Hentikan labu volumetrik dan kocok perlahan atau balikkan sampai analit benar-benar larut.
Buat serangkaian pengenceran beragam standar stok dengan mentransfer volume standar stok yang diketahui ke dalam labu volumetrik, menggunakan pipet untuk transfer yang akurat, kemudian menambahkan pelarut. Konsentrasi standar terendah harus di bawah sampel yang diantisipasi terendah untuk dianalisis. Dalam contoh minuman ringan, jika konsentrasi fruktosa terendah yang diharapkan dalam sampel adalah 2 gram / 100 mL, maka standar 1 gram / 100 mL dapat dibuat. Ini akan dilakukan dengan pengenceran standar stok sepuluh kali lipat. Seri standar harus mencakup total 5 atau 6 konsentrasi, sehingga pengenceran tambahan untuk menghasilkan standar mungkin 3, 5 dan 8 gram fruktosa / mL akan diperlukan. Anda sekarang memiliki serangkaian solusi standar untuk mengkalibrasi HPLC.