Isi
- Bagaimana Gel Elektroforesis Bekerja
- Prosedur Dasar Elektroforesis
- Menentukan Panjang Fragmen Tidak Dikenal
Ketika datang untuk mengukur panjang fragmen DNA, yang jauh lebih kecil dari sel, ahli mikrobiologi perlu trik, dan yang paling nyaman adalah elektroforesis gel. Metode ini bergantung pada fakta bahwa fragmen DNA dibebankan, dan ini merupakan alternatif untuk metode yang lebih mahal, seperti kristalografi sinar-X, yang bertanggung jawab untuk penemuan struktur DNA heliks ganda.
Bagaimana Gel Elektroforesis Bekerja
Karena molekul DNA bermuatan, mereka dipengaruhi oleh arus listrik. Ketika Anda mengaturnya dalam gel netral dan menempatkan arus melintasi gel, molekul bermigrasi menuju elektroda positif (anoda). Karena molekul DNA dengan ukuran berbeda membawa muatan yang sama, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat, sehingga proses ini memisahkan molekul menjadi pita yang dapat dibandingkan dengan sampel dengan ukuran yang diketahui.
Prosedur Dasar Elektroforesis
Gel biasanya dibuat dari agarose, polisakarida yang bila dipanaskan dalam larutan buffer membentuk gel yang agak padat dan agak berpori. Di satu sisi, gel membentuk lekukan kecil yang disebut sumur di mana peneliti menempatkan sampel DNA yang diteliti, bersama dengan sampel referensi yang diketahui panjangnya, disebut tangga DNA. Panjang fragmen tangga telah ditentukan sebelumnya dengan metode lain, seperti kristalografi sinar-X.
Ketika gel direndam dalam larutan konduksi dan tegangan diberikan, fragmen-fragmen mulai bermigrasi melalui gel - yang kecil lebih dulu dan yang lebih besar, yang lebih lambat di belakang. Mereka akhirnya membentuk diri mereka sendiri menjadi pita seperti spektrum berdasarkan ukuran.
Setelah ini terjadi, peneliti mematikan daya, meresapi gel dengan pewarna yang mengikat DVA dan memeriksa spesimen di bawah sinar ultraviolet. Menggunakan tangga sebagai referensi, peneliti dapat menentukan ukuran masing-masing fragmen dalam pita yang terlihat. Hanya pita yang terlihat - fragmen DNA individu terlalu kecil untuk dilihat.
Menentukan Panjang Fragmen Tidak Dikenal
Kemungkinan tidak setiap band dalam sampel berpasangan dengan band di tangga, sehingga untuk menentukan ukuran fragmen yang tidak diketahui ini, para ilmuwan biasanya membuat plot grafik. Pada sumbu x adalah jarak yang ditempuh oleh setiap band dalam tangga dalam milimeter, sedangkan pada sumbu y adalah ukuran masing-masing band. Ketika titik-titik dihubungkan oleh kurva, ukuran pita apa pun dapat diekstrapolasi dari kurva setelah mengukur jarak yang ditempuh oleh pita tersebut dalam milimeter.