Isi
Biru genetik sel dikodekan dalam materi genetiknya, atau DNA. Karena DNA tidak pernah meninggalkan nukleus sel, agar informasi ini masuk ke dalam sitoplasma tempat protein dan komponen biokimia lainnya berada, maka perlu terlebih dahulu mentranskripsi DNA menjadi RNA kurir (mRNA atau poli (A) RNA). MRNA ini kemudian diterjemahkan menjadi protein yang menjalankan banyak fungsi sel. Untuk mendeteksi atau mengukur mRNA yang sangat langka, membuat probe untuk microarray atau membangun perpustakaan molekul DNA komplementer, mRNA harus diisolasi. Namun, total RNA (mis. Semua RNA dalam sel) ekstraksi dan isolasi mRNA selanjutnya bukanlah proses yang saling eksklusif; yang pertama harus dilakukan agar mRNA diekstraksi.
Isolasi mRNA Dari Total RNA
Homogenisasi TRIzol: RNA total mencakup semua mRNA, RNA transfer, RNA ribosom, dan RNA nonkoding lainnya. Untuk memisahkan ini dari komponen seluler lainnya, sel pertama kali dibuka untuk melepaskan isinya. Ini dilakukan dengan resuspending sel yang dipellet dengan centrifuging (berputar dengan kecepatan tinggi) dalam TRIzol Reagent (Life Technologies). Versi lain dari TRIzol (seperti Reagen TRI Ambion) bekerja dengan cara yang sama.
Isolasi RNA Total: Serangkaian sentrifugasi digunakan untuk memisahkan berbagai komponen (protein, DNA, RNA) dari sel menjadi lapisan, atau fase, dalam suspensi. Fase atas berwarna kuning terdiri dari lemak dan dapat dibuang. Fase yang diinginkan berwarna merah, mengandung RNA total dan dipertahankan. Setelah melakukan ekstraksi fenol-kloroform dan serangkaian pencucian alkohol menggunakan isopropanol dan etanol, RNA dapat dibuat pelet untuk isolasi mRNA. Tambahkan penghambat RNase untuk mencegah enzim ini merendahkan RNA total.
Ekstraksi mRNA: Adalah umum untuk menggunakan kit untuk mengisolasi mRNA, karena protokol lab buatan sendiri tidak menghasilkan sejumlah besar mRNA yang sangat murni. Kit komersial termasuk Invitrogen FastTrack 2.0 atau Ambion's mRNA Isolation Kit Poli Murni (A). Langkah-langkah dasar ini umum untuk kit tersebut:
a) Campurkan buffer lisis yang dihambat RNase yang disediakan dalam kit dengan hingga 300 mikroliter total RNA.
b) Panaskan selama 5 menit pada 65 derajat Celcius dan kemudian segera dinginkan sampel di atas es selama satu menit.
c) Campurkan ini dengan Sodium Chloride 0,5M dan kemudian larutkan sepenuhnya Oligo dT (asam oligodeoksi timidilat) dalam sampel ini.
d) Centrifuge sampel ini dan pulihkan supernatan, yang dicuci beberapa kali dalam serangkaian buffer mengikat dan rendah garam yang disediakan dalam kit.
e) Elute mRNA beberapa kali hingga volume yang ditentukan kit (mis. 500 mikroliter) diperoleh.
f) Endapkan eluat dengan natrium asetat dan presipitasi etanol. Menangguhkan kembali hingga 20 mikroliter air yang mengandung diethylpyrocarbonate (DEPC).
g) Simpan pada -80 derajat Celcius dan periksa kualitas dan kuantitas dengan spektrofotometri.