Isi
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa. Ini adalah jenis kromatografi kolom yang bergantung pada polaritas senyawa yang berbeda dalam larutan untuk memisahkannya. HPLC berbeda dari kromatografi kolom standar karena menggunakan tekanan untuk memaksa solusi melalui kolom lebih cepat, dan karenanya menghasilkan hasil yang lebih cepat, dan terkadang lebih akurat. Tujuannya adalah untuk memisahkan senyawa dalam kolom dan mengeluarkannya secara terpisah.
Coelution
Karena kecepatan HPLC dan ketergantungan pada polaritas senyawa yang berbeda, dua senyawa dengan struktur dan polaritas yang sama dapat keluar dari peralatan kromatografi pada waktu yang bersamaan atau hampir bersamaan. Ini dikenal sebagai coelution. Coelution membuat penentuan bagian mana dari campuran yang sulit dielusi pada titik mana yang sulit.
Senyawa yang Teradsorpsi
HPLC biasanya menggunakan kolom kaca yang diisi dengan manik-manik yang terbuat dari bahan yang berbeda. Campuran dipaksa melalui kolom memiliki bahan kimia yang mengikat dengan kekuatan yang berbeda dengan manik-manik. Kekuatan ikatan, yang tergantung pada kesamaan dalam polaritas, menentukan berapa lama bahan kimia akan terikat pada manik sebelum dilepaskan. Beberapa senyawa mengikat begitu kuat sehingga pada dasarnya tidak pernah dilepaskan dari manik-manik di kolom dan tidak pernah diukur dalam larutan yang keluar dari kolom.
Biaya
Teknik pemisahan laboratorium tipikal melibatkan pengembangan uji, atau metode pemisahan, dan kemudian menerapkan uji itu untuk memisahkan senyawa individu dari suatu larutan. Namun ini biasanya menghasilkan beberapa solusi yang juga perlu menjalani prosedur, yang mengarah pada peningkatan kompleksitas yang eksponensial. Meskipun HPLC sering dapat menyederhanakan dan mempercepat proses ini, biaya pengembangan alat HPLC bisa menjadi luar biasa. Mengembangkan peralatan HPLC, meskipun jauh lebih efisien, jauh lebih mahal daripada mengembangkan tes lain untuk memisahkan senyawa. Ini membuatnya tidak layak secara finansial bagi banyak laboratorium kecil milik swasta.
Kompleksitas
HPLC tidak hanya digunakan untuk memisahkan senyawa sederhana, tetapi juga digunakan untuk mengisolasi protein spesifik dari campuran seluler. Dalam hal ini manik-manik di kolom biasanya dilapisi dengan antibodi khusus untuk protein yang perlu Anda kumpulkan. Protein mengikat antibodi dan larutan yang tersisa dilewatkan melalui kolom, kemudian protein dilepaskan menggunakan larutan lain dan dikumpulkan. Ini membutuhkan teknisi yang sangat terampil untuk memantau kolom setiap saat dan memastikan bahwa prosesnya berjalan persis seperti yang direncanakan.