Isi
DNA
Asam dan protein deoksiribonukleat. DNA diatur ke dalam unit-unit yang disebut gen, yang masing-masingnya mengkode RNA atau urutan protein tertentu. Gen dipelajari untuk mempelajari tentang struktur dan fungsi biologis, evolusi, penyakit, dan banyak aspek lain dari sistem kehidupan. Untuk mempelajari gen secara terperinci, DNA harus diisolasi dan dimurnikan dari sel yang diinginkan.
Ekstraksi DNA
Meskipun DNA dari satu sel dapat diekstraksi dan dipelajari, itu tidak cukup untuk dilihat dengan mata telanjang. Untuk mendapatkan jumlah yang cukup untuk spooling, semakin banyak sel Anda harus bekerja dengan yang lebih baik (jutaan).
Protokol yang tepat sangat bervariasi untuk memperhitungkan karakteristik unik dari sampel tertentu, tetapi langkah-langkah umumnya adalah homogenisasi, lisis, pencernaan, pemisahan, dan pengumpulan. Prosedur ini paling baik dilakukan dalam gelas kecil (tergantung ukuran sampel).
Sampel umumnya dicampur atau ditumbuk untuk memisahkan sel satu sama lain secara menyeluruh. Ini membuat bahan sel lebih mudah diakses oleh reagen yang mengikuti. Deterjen atau enzim kemudian ditambahkan ke homogenat untuk melisiskan membran sel (dan membran nuklir jika sel tersebut bersifat eukariotik) untuk membebaskan DNA. Pada titik ini, DNA dikelilingi oleh protein, lipid, karbohidrat --- segala sesuatu yang terkandung dalam sel.
Pencernaan enzimatik lebih lanjut mungkin diperlukan untuk memecah protein sehingga mereka tidak mengikat DNA dan mengganggu pengumpulannya. DNA dipisahkan dari sisa isi sel dengan menambahkan dingin, murni, etil atau isopropil alkohol. DNA tidak larut dalam alkohol ini sehingga akan mengembun untuk mencoba meminimalkan kontaknya dengan alkohol. DNA yang terkondensasi kemudian dikumpulkan, biasanya dengan sentrifugasi --- atau spooling.
Spooling DNA
Pengumpulan DNA dengan spooling efektif ketika sejumlah besar DNA diperoleh dari prosedur ekstraksi. Ini juga merupakan metode demonstrasi yang sangat baik karena kusut mengesankan DNA murni terlihat jelas.
Untuk menggulung DNA, langkah pemisahan harus dilakukan dengan hati-hati. Jika itu bukan bagian dari campuran reagen lisis yang sebelumnya ditambahkan, larutan garam pekat (natrium klorida) harus ditambahkan ke larutan sebelum langkah penambahan alkohol. Alkohol dingin secara perlahan dituangkan ke sisi tabung reaksi untuk membentuk lapisan di atas larutan encer, menghindari pencampuran. Jika dilakukan dengan benar, alkohol akan membentuk lapisan sendiri di atas lapisan asin. Kemudian muncul spooling.
Untuk mengumpulkan DNA dari lapisan asin, dengan hati-hati letakkan batang pengaduk kaca melalui lapisan alkohol hingga menyentuh bagian bawah tabung. Perlahan putar batang di antara jari, sambil menonton antarmuka antara dua lapisan. Jika ada cukup DNA, itu akan menggumpal di antarmuka antara lapisan untuk membentuk massa tembus susu. Putar batang untuk membungkus DNA di sekitarnya (itu adalah bagian spooling) dan tarik keluar dari tabung. DNA dapat ditransfer ke tabung lain alkohol murni untuk penyimpanan atau analisis lebih lanjut.