Isi
Pewarnaan Gram adalah prosedur pewarnaan diferensial yang menunjukkan bakteri mana yang Gram-positif atau Gram-negatif berdasarkan warna pewarnaannya. Aseton alkohol adalah salah satu reagen yang digunakan dalam proses ini untuk memberikan diferensiasi warna. Bakteri Gram-positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan pewarnaan ungu, sedangkan mikroorganisme Gram-negatif memiliki sedikit lapisan peptidoglikan dan pewarnaan berwarna pink.
Stain-Crystal Violet Utama
Setelah slide sampel bakteri disiapkan, kristal violet digunakan untuk menodai sampel terlebih dahulu. Pada titik ini bakteri Gram-positif dan Gram-negatif akan berwarna ungu. Biasanya violet kristal diterapkan pada slide selama 30 detik sebelum membersihkan noda berlebih dengan air. Kristal ungu dapat menempel sedikit pada lapisan peptidoglikan sehingga tidak semua noda primer akan tersapu dengan air.
Mordant-Yodium
Yodium kemudian ditambahkan ke sampel selama satu menit. Ini bertindak sebagai mordan, yang berfungsi untuk memperbaiki pewarna dalam proses pewarnaan. Yodium melakukan fungsi ini dengan mengikat ke violet kristal dan menciptakan kompleks tidak larut yang melekat jauh lebih baik ke lapisan peptidoglikan tebal yang ditemukan dalam sel bakteri Gram-positif daripada hanya kristal violet saja. Tidak ada langkah mencuci dengan air setelah menambahkan yodium.
Decolorizer-Alkohol
Baik aseton atau etil alkohol dapat digunakan sebagai zat penghilang warna. Alkohol melarutkan lipid yang ditemukan di membran sel luar dari bakteri Gram-negatif, memungkinkan kristal violet-iodine bocor keluar dari lapisan peptidoglikan yang lebih tipis. Alkohol ditambahkan selama 10 hingga 20 detik; itu dituangkan pada slide sampai semua yodium dihanyutkan dan limpasan tidak berwarna. Pada titik ini dalam proses pewarnaan Gram, bakteri Gram-negatif tidak berwarna sedangkan bakteri Gram-positif masih mempertahankan kristal ungu. Setelah selesai, slide harus dibilas dengan air untuk menghentikan efek dekolorisasi.
Counterstain-Safranin
Safranin kemudian ditambahkan untuk meningkatkan visibilitas dan kontras dengan bakteri Gram-negatif yang tidak berwarna. Noda membuat bakteri ini tampak merah muda di bawah mikroskop. Karena pewarna ditambahkan ke seluruh sampel, pewarna ini juga menodai bakteri Gram-positif, tetapi yang lebih gelap dari kristal violet menyembunyikan warna pink safranin yang lebih terang. Setelah sampel slide telah dibanjiri dengan safranin selama sekitar satu menit, air digunakan untuk membersihkan noda berlebih yang tidak melekat pada sel bakteri.